本发明属于基因突变
技术领域：
，具体涉及一种检测肺动脉高压病的alk1基因探针组及其应用。
背景技术：
：肺动脉高压(ph)是一种在静息状态下，经右心导管检测平均肺动脉压力≥25mmhg的肺血管疾病。美国50家医院入院记录数据显示特发性和家族性ph人数占ph患者总人数的49.7％，其中部分特发性和家族性ph患者是激活素受体样激酶1(activinreceptor-likekinase-1，alk1)基因突变携带者。因此设计用于alk1基因突变检测的基因探针对于ph精准诊疗具有重要的意义。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种检测肺动脉高压病的alk1基因探针组。本发明的目的还在于提供上述alk1基因探针组在制备肺动脉高压病的诊断试剂盒方面的应用。本发明的最后一个目的在于提供一种非疾病诊断治疗目的的肺动脉高压病的基因突变体外检测方法。本发明的上述第一个目的是通过如下技术方案来实现的：一种检测肺动脉高压病的alk1基因探针组，所述基因探针组是用于检测激活素受体样激酶1(alk1)基因突变的基因探针组合物，所述基因探针组合物由以下265条探针组成，具体如下所示(基因探针在人类参考基因组hg19对应染色体上的位置)：本发明中的alk1基因探针组是用于肺动脉高压相关基因alk1基因突变检测的探针组合，该基因探针组包括针对alk1基因5’utr区、外显子区、剪切区和3’utr区的一组探针组合物。优选的，所述探针组合物覆盖上述alk1基因的外显子区和表达调控区，是用于检测alk1基因的致病碱基突变如碱基替换、基因缺失、基因插入的探针组合物。优选的，所述探针组合物中每两个相邻的探针序列之间存在重叠，每两个相邻的探针序列之间的重叠的长度为每条探针长度的1/2～2/3，在每条探针上形成两层或三层的探针覆盖区域。本发明的上述第二个目的可以通过如下技术方案来实现：上述alk1基因探针组在制备肺动脉高压病的诊断试剂盒方面的应用。本发明的上述最后一个目的可以通过如下技术方案来实现：一种非疾病诊断治疗目的的肺动脉高压病的基因突变体外检测方法，包括以下步骤：(1)提取受试者的基因组dna，或者提取受试者的rna，反转录成cdna；(2)将所述dna或cdna打断至150-200bp的范围；(3)对上述打断的dna采用illuminatruseqdnalibrarypreparation试剂盒，进行dna小片段文库的制备；(4)将dna小片段文库和上述的alk1基因探针组进行杂交，检测基因突变。本发明的优点是：相对于全基因组测序，大大节约了所需要的测序数据量；一次性检测致病基因的所有突变，实现对疾病基因诊断的零遗漏，为疾病的治疗和干预提供保障；高深度的测序，实现对基因突变的高准确性检测；成本低，对测序数据量要求不高；高深度测序实现对突变检测的准确性。具体实施方式以下通过参考示范性实施例，本发明的目的和功能以及用于实现这些目的和功能的方法将得以阐明。然而，本发明并不受限于以下所公开的示范性实施例；可以通过不同形式来对其加以实现。说明书的实质仅仅是帮助相关领域技术人员综合理解本发明的具体细节。实施例1基因测序是近几年在高科技领域出现的重大科技进展之一，其主要原理是将特异性的基因探针捕获目标区域，与实际样本进行杂交反应，通过高通量二代测序获得所有待检基因的信息。该技术以其高通量、快速、准确性高等优点为肺动脉高压病遗传学诊断提供一条新的解决途径，对患儿的临床治疗、预后评估具有重要作用。在本发明中，人类参考基因组是hg19。对于本申请说明书和权利要求书中，提及基因序列，本领域技术人员应当理解，实际包括互补双链的任意一条，或者两条。为了方便，在本说明书和权利要求书中，虽然多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。例如提及一条探针序列，实际上包括该序列以及其互补序列。本领域技术人员还可以理解，利用一条链可以检测另一条链，反之亦然。本申请中的基因序列包括dna形式或rna形式，公开其中一种，意味着另一种也被公开。例如提及一条探针序列，实际也包括相应的rna序列。在本发明中，针对基因的编码序列，由5’往3’方向，按照序列反向互补的原则，从第一个碱基开始设计长度为100bp的探针序列，并且每两个相邻的探针序列之间存在重叠，每两个相邻的探针序列之间重叠是所述探针长度的1/2或2/3。对于探针在每两个相邻的探针序列之间的重叠，每两个相邻的探针序列之间重叠是探针长度的1/2或2/3，这是因为会对每一个区域都形成2层或者3层的探针覆盖，因此探针覆盖均匀，进而不影响捕获的均一性，而探针覆盖不均匀会影响到捕获的均一性。因此，每两个相邻的探针序列之间重叠是探针长度的1/2或2/3。在每两个相邻的探针序列之间重叠是探针长度的1/2的情况下，优选探针长度是偶数；在每两个相邻的探针序列之间重叠是探针长度的2/3的情况下，优选探针长度是3的整倍数。但是，在探针长度不是偶数或3的整倍数的情况下，重叠取探针长度1/2或2/3的近似整数也是可以的，虽然其效果不如探针长度是偶数或3的整倍数的情况。在每个探针序列的5’端和3’端，分别添加taggtgtgtaggcgc和gtcagctagtacgca引物序列，这是为了pcr扩增富集探针而加入的引物结合序列，这样使用一对引物即可实现对所有探针的扩增。对于正向引物ttagataggtgtgtaggcgc和反向引物taaggtgcgtactagctgac，选择这对引物是因为它们在人基因组上没有同源序列，对pcr扩增不会产生干扰，它们自身之间也没有重叠和干扰。基因对应的探针对应染色体上的位置表如下表1中所示：表1基因探针组合物在对应染色体上的位置实施例21.遗传代谢病相关致病基因的试剂盒制备2.试剂盒包括如下方法制备的遗传代谢病相关致病基因dna探针文库：1)根据人类参考基因组hg19，结合ensembl、ccds、gencode、vega、snp以及cytoband数据库，获取激活素受体样激酶1编码序列；2)针对alk1基因5’utr区、外显子区、剪切区和3’utr区编码序列，由5’往3’方向，按照序列反向互补的原则，从第一个碱基开始设计长度为100bp的探针序列，并且每两个相邻的探针序列之间存在部分重叠；3)在每个探针序列的5’端和3’端，分别添taggtgtgtaggcgc和gtcagctagtacgca序列，形成两端带有同样序列的探针序列列表；4)采用寡核苷酸原位合成技术，在芯片上进行寡核苷酸的大规模合成上述探针序列列表中的序列；5)用氨水将芯片上的寡核苷酸洗脱下来，溶于100微升的超纯水中，形成寡核苷酸混合物；6)通过pcr的方法，采用5’端带有生物素标记的正向引物ttagataggtgtgtaggcgc和5’端带有同样标记的反向引物taaggtgcgtactagctgac，对寡核苷酸混合物进行扩增，形成带生物素标记的遗传代谢病相关致病基因dna探针文库。反应体系如下：kapa2gbufferb5×：10μl；dntp(10mm)：1μl；正向引物(25μm)：0.5μl；反向引物(25μm)：0.5μl；寡核苷酸混合物：5μl；kapa2grobustdnataq：0.8μl；h2o：32.2μl。反应条件如下：2.遗传代谢病相关致病基因的试剂盒筛查：1)取人受试者的基因组dna200～500ng，采用超声破碎仪，打断至150-200bp的范围；2)采用illuminatruseqdnalibrarypreparation试剂盒，进行dna小片段文库的制备；3)将dna小片段文库和上述制备的遗传代谢病相关致病基因dna探针文库进行液相杂交，进行遗传代谢病相关致病基因的捕获；4)采用pcr，以illuminapepcrprimer1.0:aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatct和illuminapepcrprimer2.0：caagcagaagacggcatacgagatcggtctcggcattcctgctgaaccgctcttccgatct为引物，对捕获后的产物进行扩增，得到测序文库；反应体系如下：捕获产物：10μl；pepcrprimer1.0(25μm)：2.5μl；pepcrprimer2.0(25μm)：2.5μl；phusionhigh-fidelity2×pcrmastermix：25μl；超纯水：10μl；反应条件如下：5)采用illumina高通量测序仪nextseq550，对测序文库进行上机测序，得到遗传代谢病相关致病基因的测序数据；6)利用bwamem软件，将测序数据与到人类参考基因组hg19进行比对，所用的参数为：bwamem-m-k40-t8-r″@rg\tid:hiseq\tpl:illumina\tsm:sample″，从而得到与参考基因组不同的单核苷酸多态性、插入或缺失，即所检测到的基因突变。3.目标区域捕获效果评估：1)采用samtools-1.2软件中的samtoolsstats工具统计数据的大小、比对率、重复率、质量值，接着再用软件中的samtoolsdepth工具，计算目标区域每个位置的测序深度；2)用比对到目标区域的数据量除以总数据量，获得捕获效率；3)根据目标区域每个位置的测序深度，分别统计测序深度≥1、≥4、≥10及≥20的碱基数量，再将该碱基数量除以目标区域的总碱基数量，从而得到1×覆盖率、4×覆盖率、10×覆盖率及20×覆盖率的参数。以下为部分ph患者的部分测试结果：患者：该患者在3’utr区检测到多个突变，导致acvrl1基因表达异常。对照：突变名称突变碱基参考碱基基因型功能区域突变性质rs2071218ct0/1intronicbenignrs2071219ag0/1intronicbenign该名正常对照志愿者在alk1基因内含子区域检测到两个良性突变。虽然已经结合优选实施例对本发明进行了描述，但应当理解本发明的保护范围并不局限于这里所描述的实施例。结合这里披露的本发明的说明和实践，本发明的其他实施例对于本领域技术人员都是易于想到和理解的。说明和实施例仅被认为是示例性的，本发明的真正范围和主旨均由权利要求所限定。当前第1页1 2 3
技术特征：
1.一种检测肺动脉高压病的alk1基因探针组，其特征是：所述alk1基因探针组是用于检测激活素受体样激酶1(alk1)基因突变的基因探针组合物，所述基因探针组合物由以下265条探针组成，具体如下所示：
2.根据权利要求1所述的检测肺动脉高压病的alk1基因探针组，其特征是：所述基因探针组覆盖权利要求1中所述alk1基因的外显子区和表达调控区，是用于检测alk1基因的致病碱基突变如碱基替换、基因缺失、基因插入的基因探针组。
3.根据权利要求1所述的检测肺动脉高压病的alk1基因探针组，其特征是：所述探针组合物中每两个相邻的探针序列之间存在重叠，每两个相邻的探针序列之间的重叠的长度为每条探针长度的1/2～2/3，在每条探针上形成两层或三层的探针覆盖区域。
4.权利要求1-3任一项中所述alk1基因探针组在制备肺动脉高压病的诊断试剂盒方面的应用。
5.一种非疾病诊断治疗目的的肺动脉高压病的基因突变体外检测方法，其特征是包括以下步骤：
(1)提取受试者的基因组dna；或者提取受试者的rna，反转录成cdna；
(2)将所述dna或cdna打断至150-200bp的范围；
(3)对上述打断的dna采用illuminatruseqdnalibrarypreparation试剂盒，进行dna小片段文库的制备；
(4)将dna小片段文库和权利要求1-3中任一项所述的alk1基因探针组进行杂交，检测基因突变。
技术总结
本发明公开了一种检测肺动脉高压病的ALK1基因探针组，所述基因探针组是用于检测激活素受体样激酶1(ALK1)基因突变的基因探针组合物，所述基因探针组合物由265条探针组成，本发明还公开了上述ALK1基因探针组在制备肺动脉高压病的诊断试剂盒方面的应用以及利用上述ALK1基因探针组进行的非疾病诊断治疗目的的肺动脉高压病的基因突变体外检测方法。
技术研发人员：卢文菊;王健;陈灵丹
受保护的技术使用者：广州医科大学附属第一医院(广州呼吸中心)
技术研发日：.09.25
技术公布日：.02.28
