对于二代数据的表达差异分析，理论上应该用reads counts进行计算。这个在我们论坛的专题帖已经有解释：
第14期“基因表达量计算和差异表达分析(下)”【视频】
/forum/thread-236-1-12.html
同时，在我们OS-tools已经有基于edgeR软件的差异分析工具。但依然有网友问，如果手头没有reads count数据，而只有RPKM/FPKM值该怎么办？
这个时候，就只能退而求其次，使用t检验或者方差分析。但注意，这两种检验是基于正态分布的检验方法，是不适用于二代数据的，对低丰度基因的检验会产生大量假阳性。不到万不得已不要使用这类方法。
如果非使用不可，可以：
使用以下的R脚本进行批量差异检验(t检验或方差分析)；
请将在两组样本中表达量RPKM值均低于1的基因过滤掉(t检验和方差分析在低丰度基因中，假阳性过高，P value不可靠)。
请确定你认真看了上面两点使用建议，再开始看代码。
# t检验的代码如下：
a=read.table(“all_fpkm.txt”,header=T,sep=”\t”)
#预生成2个长度与输入文件行数相同的全为0的向量，将用于存储p value和差异倍数(log2FC)
Pvalue
log2_FC
# 2~4列是处理组1,5~7列是处理组2；
#将使用循环对每一行进行t检验
#如果某一行两组的标准差都等于0，将无法进行t检验，所以这些行使用NA替代
#每一行计算得到p value和log2FC将被加入原文件的后两列；
#计算log2FC时，每组均值加0.001，是为了防止分母为0导致bug；
for(i in 1:nrow(a)){
if(sd(a[i,2:4])==0&&a[i,5:7]==0){
Pvalue
log2_FC
}else{
y=t.test(as.numeric(a[i,2:4]),as.numeric(a[i,5:7]))
Pvalue
log2_FC
}
}
# 对p value进行FDR校正
fdr=p.adjust(Pvalue, “BH”)
# 在原文件后面加入log2FC，p value和FDR,共3列；
out
write.table(out,file=”ttest.out.xls”,quote=FALSE,sep=”\t”,row.names=FALSE)
##########################我的理解##################################
我感觉代码有问题，经过我改完以后代码如下(我的数据是2个重复，我的测试数据： test_of_yangl.txt )：最后我觉得这么算的P值不靠谱，不推荐使用自己算P的值
##setwd(“F:/”)
a=read.table("RA24C.txt",header=T,sep="\t")
a
#预生成2个长度与输入文件行数相同的全为0的向量，将用于存储p value和差异倍数(log2FC)
Pvalue
log2_FC
# 2~4列是处理组1,5~7列是处理组2；
#将使用循环对每一行进行t检验
#如果某一行两组的标准差都等于0，将无法进行t检验，所以这些行使用NA替代
#每一行计算得到p value和log2FC将被加入原文件的后两列；
#计算log2FC时，每组均值加0.001，是为了防止分母为0导致bug；
for(i in 1:nrow(a)){
if(sd(a[i,2:3])==0&&sd(a[i,4:5])==0){
Pvalue[i]
log2_FC[i]
}else{
y=t.test(as.numeric(a[i,2:3]),as.numeric(a[i,4:5]))
Pvalue[i]
log2_FC[i]
}
}
# 对p value进行FDR校正
fdr[i]=p.adjust(Pvalue[i], "BH")
# 在原文件后面加入log2FC，p value和FDR,共3列；
out
write.table(out,file="RA24C.out.xls",quote=FALSE,sep="\t",row.names=FALSE)
##############################################################
#方差分析的代码如下，与t检验相比，逻辑相同，只是有些细微的修改。
a=read.table(“all_fpkm.txt”,header=T,sep=”\t”)
#预生成2个长度与输入文件行数相同的全为0的向量，将用于存储p value和差异倍数(log2FC)
Pvalue
log2_FC
#确定分组信息
type
# 2~4列是处理组1,5~7列是处理组2；
#将使用循环对每一行进行方差检验
#两组表达量都是0的基因，不检验；
#每一行计算得到p value和log2FC将被加入原文件的后两列；
#计算log2FC时，每组均值加0.001，是为了防止分母为0导致bug；
for(i in 1:nrow(a)){
if(sum(a[i,2:4])==0&&sum(a[i,5:7])==0){
Pvalue[i]
log2_FC[i]
}else{
y=aov(as.numeric(a[i,2:7])~type)
Pvalue[i]
log2_FC[i]
}
}
# 对p value进行FDR校正
fdr=p.adjust(Pvalue, “BH”)
# 在原文件后面加入log2FC，p value和FDR,共3列；
out
write.table(out,file=”anova.out.xls”,quote=FALSE,sep=”\t”,row.names=FALSE)
另外，如果没有R基础的同学，看这一期视频，学完就基本可以保证正确使用这个脚本：
第12期在线交流 R语言入门——软件简介与实操【视频】
/forum/thread-133-1-1.html
备注：理论上如果你理解了这个方法，可以进行任何组间的差异检验。只要把检验方法的部分的相关语句替换就可以了，例如可以替换为秩和检验、相关性检验等；
脚本和测试数据我们已经上传了，请点击“阅读原文”跳转到论坛下载。
