对于冠状病毒假病毒中和抗体的研究，我们还得从SARS说起，早在，SARS病毒突然爆发，搞得人们措手不及。虽然说SARS病毒来去匆匆，使得很多相关研究被搁浅，但仍然有很多项目被执行了下来，对我们应对今天的SARS-CoV-2不无借鉴意义。首先，我们来看一下，英国伦敦大学Robin A. Weiss教授团队在Emerging infectious Disease上发表的文献：Longitudinally Profiling Neutralizing Antibody Response to SARS Coronavirus with Pseudotypes。文中指出，SARS-CoV棘突蛋白S是中和抗体的主要靶标，通过构建逆转录病毒S相关假病毒，成功制备SARS-CoV的中和抗体，并发现该抗体对患者SARS-S蛋白具有中和反应。这项研究对于自然感染过程中的中和抗体效价及疫苗临床前评估具有重要的意义。同时，研究者在小鼠和仓鼠中进行的临床前研究发现中和抗体可明显抵御活病毒的攻击，这些研究结果说明，中和抗体药物的研究在一定程度上可以抵抗病毒的侵袭。
我们再把时间拉回到3月，中国医科院病原微生物研究所在Nature Communication上发表研究论文，利用假病毒系统证明了SARS-CoV-2-S 蛋白在病毒入侵细胞时表现出哪些特征，并对其与SARS-CoV产生的免疫交叉反应进行了阐述。该研究使用慢病毒SARS-CoV-2-S假病毒系统，确定了Huh7、Vero81、LLCMK2、Calu3等细胞对于该系统易感，文中还详细论述了病毒与受体ACE2结合进入细胞的途径。我们知道，CoV S蛋白是典型的I类病毒融合蛋白，需要蛋白酶切割来激活S蛋白的融合潜能，在病毒S蛋白的S1和S2之间进行切割，根据病毒株和细胞类型，CoV S蛋白可能会被一种或几种宿主蛋白酶切割，包括弗林蛋白酶、胰蛋白酶、组织蛋白酶、跨膜丝氨酸蛋白酶2（TMPRSS-2）、TMPRSS-4或人气道胰蛋白酶样蛋白酶（HAT）。这些蛋白酶在靶细胞上的存在很大程度上决定了冠状病毒是通过质膜还是通过胞吞作用进入细胞。
图1. SARS-CoV-2-S假病毒侵入细胞
(Xiuyuan Ou et al. )
研究进一步使用可溶性hACE2的流式细胞术和竞争抑制实验分析验证了SARS-CoV-2和SARS-CoV两种病毒的S蛋白都以hACE2作为病毒结合的受体。
冠状病毒S蛋白是病毒毒力的关键因子，是决定病毒毒力、组织嗜性和宿主范围的关键部分，也是中和抗体和疫苗设计的主要靶标。那么对于SARS-CoV-2-S与SARS-CoV-S产生的免疫交叉反应是如何体现的呢？
图2. SARS和COVID-19患者血清的有限交叉中和反应
(Xiuyuan Ou et al. )
研究发现康复的SARS患者的血清对SARS-CoV S假病毒颗粒的入侵表现出强烈抑制作用，并且对SARS-CoV-2 S假病毒颗粒具有适度的中和活性。
随着时间的推移，7月份中和抗体的研究结果逐渐浮出水面，各种友好的结果让我们对抗疫的未来充满了信心。7月9日，北京大学基因组学先进创新中心（ICG）和生物医学先锋创新中心（BIOPIC）等单位合作在Cell上发表文献，通过对新冠肺炎康复患者的B细胞进行高通量单细胞测序，鉴定出了针对SARS-CoV-2的有效中和抗体。
图3. SARS-CoV-2中和抗体的产生
(Yunlong Cao et al. )
研究通过高通量scRNA/VDJ-seq测序，鉴定了8,558个IgG1+抗原结合克隆型，从60名康复患者中发现14种有效的SARS-CoV-2中和抗体，还用SARS-CoV-2真病毒和SARS-COV-2 VSV假病毒系统进行验证，发现其中最有效的中和抗体是BD-368-2，而且BD-368-2对感染SARS-COV-2的hACE2转基因小鼠表现出较强的治疗和预防作用。同时，研究利用了生物信息学的分析方法，对单克隆抗体CDR3H结构进行预测，验证实验发现，mAb中与SARS-CoV中和抗体m396高度相似的CDR3H结构对SARS-CoV-2具有非常高的中和效力。
图4. BD-368-2对感染SARS-CoV-2的hACE2转基因小鼠有较高的治疗和预防作用
(Yunlong Cao et al. )
7月23日，中科院生物物理所王祥喜研究员与多个团队合作，通过噬菌体展示技术构建了冠状病毒抗体库，经过高通量筛选鉴定出了一株对β冠状病毒具有广谱中和能力的抗体H014。
图5. 交叉中和抗体H014的验证
(Zhe Lv et al. )
人源化单克隆抗体H014，通过与S受体结合域（RBD）结合，可有效地中和假病毒SARS-CoV-S PSV以及真病毒SARS-CoV-2。在hACE2小鼠模型中，H014的给药可降低感染肺部的SARS-CoV-2病毒滴度，减轻肺部病理变化。
以上研究为我们提供了中和抗体筛选的方式以及相应的验证结果，对抗病毒药物的开发具有重要的指导意义，同时，为疫苗靶点的探索指明了方向。
新冠疫苗的研发进展
截止7月21日，世界范围内已经有25种新冠候选疫苗进入临床试验阶段，其中至少有4种疫苗进入III期临床试验。
疫苗是将病原微生物经过人工减毒、灭活或利用基因工程等方法制备的用于预防传染病的自动免疫制剂。传统的疫苗分为人工主动免疫和被动免疫疫苗，人工主动免疫疫苗分为三类，一是灭活疫苗，二是减毒活疫苗，三是类毒素疫苗。人工被动免疫的方式有以下四种，一是抗毒，二是人免疫球蛋白制剂，三是细胞因子制剂，四是单克隆抗体制剂。两种方式的免疫均能使机体增强抗病能力，减少传染病的发生。科技的进步带来了疫苗制备方式的创新，根据不同制备方式，目前已有的新型疫苗类型有亚单位疫苗、结合疫苗、合成肽疫苗和基因工程疫苗（重组抗原疫苗/重组载体疫苗/DNA-RNA疫苗/转基因植物疫苗）。
回到新冠疫苗的研究上，7月14日，美国Moderna公司研发的候选疫苗mRNA-1273在100mg免疫剂量下可激发人体较好的中和抗体反应和偏向于Th1 CD4型细胞免疫应答，不良反应相对温和，后期的临床试验正在进行。7月20日，牛津大学和军事医学科学院陈薇院士团队腺病毒载体疫苗 ChAdOx1 nCoV-19（AZD1222）II期临床结果揭晓，令人兴奋的是，该研究评估了腺病毒Ad5载体的候选COVID-19疫苗的免疫原性和安全性，确定候选疫苗的合适剂量用于下一步的有效性研究。同在7月20日，德国 BioNTech 公司联合美国辉瑞等机构在预印本网站medRxiv发布了RNA疫苗的1/2期临床试验结果。通过脂质纳米颗粒处理的RNA疫苗能激发受试者细胞免疫应答和体液免疫应答。研究发现，BNT162b1编码SARS-CoV-2棘突蛋白的受体结合域（RBD），BNT162b1表达的RBD抗原与T4纤维蛋白衍生的“foldon”三聚结构域融合，通过多价重组增加其免疫原性。
这些成果的展示，体现了科技的发展与人类的进步，但是在疫苗安全效用评估的过程中，我们不得不充分考虑到ADE（antibody-dependent enhancement）效应的出现。
那么什么是ADE呢？早在1964年，Hawkes等在虫媒病毒的研究中提到了“抗体依赖性感染增强”的假说，ADE主要表现为病毒在低浓度免疫血清中的复制被促进而不是被抑制，这也是当初登革热出血症和登革热休克综合症产生的主要原因。而对于新冠病毒，是否也会出现这样一种令人担忧的现象呢？
图6. 冠状病毒抗体反应的潜在结果
a. 在抗体介导的病毒中和过程中，与病毒刺突蛋白的受体结合结构域（RBD）以及其他结构域结合的中和抗体可防止病毒黏附于受体ACE2上。
b. 在感染的抗体依赖性增强过程中，低质量、少量和非中和性抗体会通过Fab结构域与病毒颗粒结合。单核细胞或巨噬细胞上表达的Fc受体（FcR）与抗体Fc结构域结合并促进病毒的进入和感染。
c. 在抗体介导的免疫增强过程中，低质量、少量和非中和性抗体与病毒颗粒结合。Fc结构域与受体结合后，FcR启动信号，促炎性细胞因子上调同时抗炎性细胞因子下调。免疫复合物和病毒RNA通过Toll样受体3（TLR3）、TLR7或TLR8发出信号以激活宿主细胞，从而导致免疫病理学现象的发生。
研究表示，在SARS-CoV感染中，ADE是由于病毒与在不同免疫细胞（包括单核细胞、巨噬细胞和B细胞）上表达的Fc受体（FcR）结合而发生的。预先存在的SARS-CoV特异性抗体可能会促进病毒进入表达FcR的细胞。实际上，通过ADE感染巨噬细胞不会导致有效的病毒复制和脱落。相反，病毒抗体免疫复合物的内化可通过FcRs5激活髓样细胞来促进炎症和组织损伤。通过此途径进入的病毒可能会与模式识别受体TLR3、TLR7和TLR8结合。巨噬细胞通过ADE吸附SARS-CoV病毒导致TNF和IL-6的产生升高。因此，在对疫苗进行研发的过程中，我们不得不考虑可能出现的ADE效应。那么，如何能够最大限度地避免该现象在人体中发生，那就是疫苗应用前的模式动物安全性验证。
模式动物应用于疫苗安全性验证
6月份，赵金存教授团队研发制备腺病毒载体新冠小鼠模型，通过实验验证，发现该方法所制备的小鼠模型能够产生有效的中和抗体，对疫苗和药物评价具有非常重要的意义。同时，华盛顿大学医学部也利用AdV-hACE2模型制备了高效中和抗体，到7月份，疫苗的研究进展相继被报道，美国Moderna公司开发的mRNA-1273和德国BioNTech等机构研发的纳米颗粒mRNA疫苗取得了有效进展，激发了受试者产生免疫应答并产生中和抗体。我国陈薇院士团队联合牛津大学制备的腺病毒载体疫苗ChAdOx1 nCoV-19同样产生了令人期待的好结果。
这些研究，无一不让我们更加期待模式动物的广泛应用。疫情给我们最深的体会大概就是，有史以来全民对病毒的了解恐怕没有比新冠病毒更深入的了。随着科技的进步，全球医疗健康水平会进入到一个新的阶段，人们对生命本质的了解会更加透彻。
童话很美好，我们的未来也可期。
参考文献：
1. Nigel J. Temperton, Paul K. Chan, Graham Simmons et al. Longitudinally Profiling Neutralizing Antibody Response to SARS Coronavirus with Pseudotypes. Emerging infectious Disease. .
2. Bisht H, Roberts A, Vogel L, et al. Severe acute respiratory syndrome coronavirus spike protein expressed by attenuated vaccinia virus protectively immunizes mice. Proc Natl Acad Sci U S A. .
3. Yang ZY, Kong WP, Huang Y, et al. A DNA vaccine induces SARS coronavirus neutralization and protective immunity in mice. Nature. .
4. Xiuyuan Ou, Yan Liu, Xiaobo Lei, et al. Characterization of spike glycoprotein of
SARS-CoV-2 on virus entry and its immune cross-reactivity with SARS-CoV. Nature communication. .
5. Yunlong Cao, Bin Su, Xianghua Guo，et al. Potent Neutralizing Antibodies against SARS-CoV-2 Identifified by High-Throughput Single-Cell Sequencing of Convalescent Patients’ B Cells. Cell. .
6. Zhe Lv, Yong-Qiang Deng, Qing Ye, et al. Structural basis for neutralization of SARS-CoV-2 and SARS-CoV by a potent therapeutic antibody. Science..
7. Feng-Cai Zhu, Xu-Hua Guan, Yu-Hua Li, et al. Immunogenicity and safety of a recombinant adenovirus type-5-vectored COVID-19 vaccine in healthy adults aged 18 years or older: a randomised, double-blind, placebo controlled, phase 2 trial. The Lancet. .
8. L.A. Jackson, E.J. Anderson, N.G. Rouphael, et al. An mRNA Vaccine against SARS-CoV-2 — Preliminary Report. The new england journal of medicine. .
9. Ugur Sahin, Alexander Muik, Evelyna Derhovanessian，et al. Concurrent human antibody and TH1 type T-cell responses elicited by a COVID-19 RNA vaccine. medRxiv preprint doi: /10.1101/.07.17.0533.
10. Nelson Lee, P.K.S Chan, Margaret Ip, et al. Anti-SARS-CoV IgG response in relation to disease severity of severe acute respiratory syndrome. J. Clin. Virol. .
11. David J DiLillo, Peter Palese, Patrick C Wilson et al. Broadly neutralizing anti-influenza antibodies require Fc receptor engagement for in vivo protection. J. Clin. Invest. .
12. Akiko Iwasaki and Yexin Yang. The potential danger of suboptimal antibody responses in COVID-19. Immunology. .
13. Jing Sun, Zhen Zhuang, Jian Zheng et al. Generation of a Broadly Useful Model for COVID-19 Pathogenesis Vaccination, and Treatment. Cell.
14. Ahmed O. Hassan, James Brett Case, Emma S. Winkler et al. A SARS-CoV-2 infection model in mice demonstrates protection by neutralizing antibodies. Cell.
15. Shi-Hui Sun, Qi Chen, Hong-Jing Gu et al. A mouse Model of SARS-CoV-2 infection and Pathogenesis. Cell host microbe. .
