海棠酵素
海棠酵素作为人们喜爱的水果类酵素，含有多糖、有机酸、短链脂肪酸、氨基酸、生物活性肽、生物酶、多酚、黄酮等生物活性物质，赋予酵素多种功能，具有生津止渴、健脾止泻的作用，治疗消化不良、食积腹胀、增强对疾病的抵抗力等功能，目前对海棠酵素的研究主要在发酵条件和生产工艺的优化方面。
酵素作为一款新型的发酵食品，众多酵素产品的功能特性、发酵过程的控制尚不清楚。目前，对其发酵理论研究、生产工艺研究和功能作用机制的研究也较少。一方面，由于目前多数酵素产品采用自然发酵，其生产工艺和发酵菌种容易受到环境条件的影响，导致产品的品质和质量不稳定，因此对酵素发酵过程中微生物菌相的分析及对发酵微生物的了解就显得非常重要。目前，关于海棠酵素中微生物菌相的研究还尚未相关报道，本研究采用高通量测序技术，对海棠酵素发酵过程中的微生物菌相构成进行分析；同时采用传统微生物培养法分离、纯化海棠酵素发酵的优势微生物菌种，了解其发酵过程优势微生物，并获得纯培养物，为海棠酵素的接种发酵提供理论基础和菌种资源；最后，通过小鼠动物实验，研究海棠酵素对小鼠肠道菌群的影响，为揭示海棠酵素的益生功能奠定理论基础。
01
材料与方法
材料与试剂
材料：海棠酵素
试剂：革兰氏染色试剂盒，无水乙醇（分析纯）。
培养基：溴甲酚绿（bromocresol green,BCG）牛乳培养基；溴甲酚紫显色培养基；酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose,YPD）培养基。
仪器与设备
HVA-85型全自动高压蒸汽灭菌器，Multiskan GO型酶标仪，YS100生物显微镜，HFsafe 900型超净工作台。
实验方法
海棠酵素活菌数分析及菌株分离：将海棠酵素摇晃均匀，吸取500μL到装有4.5mL无菌生理盐水的试管中，按10倍系列梯度稀释至10-6，分别取稀释度为10-3、10-4、10-5的稀释液100μL分别涂布于BCG牛乳培养基（用于乳酸菌的分离）、YPD培养基（用于酵母菌的分离）、溴甲酚紫显色培养基（用于醋酸菌的分离）中，作3次平行试验。将BCG牛乳培养基置于37℃条件下培养1～2d，将YPD培养基置于30℃条件下培养2～3d，将溴甲酚紫显色培养基置于28℃条件下培养2～3d，观察菌落形态并计数。挑选单个菌落进行显微镜观察，同时记录菌体的形态特征。将纯化后的菌株采用甘油-80℃保藏并编号。
分离菌株的分子生物学鉴定：采用细菌16SrDNA通用引物对细菌的16SrDNA序列进行PCR扩增。采用真菌18SrDNA对真菌的18SrDNA序列进行PCR扩增。通过2%琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行分析，将PCR扩增产物纯化后委托苏州GENEWIZ公司进行测序。将测序结果提交至美国国立生物技术信息中心的Gen Bank数据库中进行基本局部比对搜索工具（basic local alignment search tool,BLAST），选取同源性较高的模式菌株的16SrDNA或18SrDNA序列，采MEGA7.0.14软件中的邻接（neighbor-joining,NJ）法构建系统发育树。
海棠酵素发酵过程中微生物菌相变化分析：当海棠酵素发酵至0d、4d、13d、20d、25d、31d时取样，委托苏州金唯智生物科技有限公司进行高通量测序，研究海棠酵素发酵过程中菌相变化情况。海棠酵素的操作分类单元种类分析：OTU数量可以代表物种的丰度，将分析得到的序列按照相似性进行归类，将序列相似度>97%的序列定义为一个OTU。海棠酵素细菌和真菌菌群结构分析：通过R语言统计和分析作图，可得各样本在不同分类水平下含量较高的前30种微生物菌相的相对丰度图，展示海棠酵素微生物群落组成的种类和相对含量。海棠酵素菌相的a多样性分析：主要包括超1(Chao1）指数、ACE指数、香农（Shannon）指数、辛普森（Simpson）指数和Coverage指数，其中Chao1指数和ACE指数为菌群丰度指数；Shannon指数和Simpson指数为菌群多样性指数；Coverage指数代表样本的测序深度，是指各样本文库的覆盖率，其数值越高则样本中序列没有被测出的概率越低。
海棠酵素改善小鼠肠道菌群功能探究：小鼠粪便的收集，选取6周龄雄性昆明小鼠16只，随机分为空白组和实验组，每组8只。空白组小鼠灌胃0.86%生理盐水，实验组小鼠灌胃海棠酵素原液，每天灌胃一次，灌胃0.4mL，连续灌胃28d。取空白组灌胃28d后和实验组小鼠灌胃0d和28d后的3组小鼠粪便，依次命名为K组（空白组）、G组（灌胃前组）、S组（实验组）委托谷禾健康生物科技公司进行小鼠肠道菌群分析。采用俞赟霞等的方法，对3组小鼠粪便进行高通量测序，分析不同分类水平上微生物组成差异及变化情况和微生物多样性，研究海棠酵素改善小鼠肠道菌群的能力。
02
结果与分析
海棠酵素中微生物组成及含量分析
海棠酵素中活菌统计结果见表1。由表1可知，海棠酵素中乳酸菌、醋酸菌、酵母菌含量分别为（4.4±0.1）×107CFU/mL、（5.4±0.1）×108CFU/mL和（5.0±0.2）×105CFU/mL。
表1 海棠酵素中微生物含量
海棠酵素中微生物的分离及鉴定
通过传统分离培养法从海棠酵素产品中共分离纯化出9株菌株，其编号及形态见表2，系统发育树见图1。
表2 海棠酵素中分离菌株的菌落及细胞形态
图1 分离细菌（a）及真菌（b）的系统发育树
海棠酵素微生物菌相分析
海棠酵素发酵过程中微生物菌相丰富度分析：海棠酵素发酵过程中（0～31 d）微生物菌相丰富度分析结果见表3。
表3 海棠酵素发酵过程中微生物丰富度变化
海棠酵素发酵过程中微生物组成分析：海棠酵素发酵过程中（0～31d）细菌菌群的组成见图2。
图2 基于门（a）、纲（b）、目（c）、科（d）及属（e）水平海棠酵素发酵过程中细菌的相对丰度
海棠酵素发酵过程中（0～31 d）真菌菌群的组成见图3。
海棠酵素发酵过程中微生物菌相a多样性分析：海棠酵素发酵过程中微生物a多样性分析结果见表4。
表4 海棠酵素发酵过程中细菌和真菌的α多样性分析
海棠酵素改善小鼠肠道菌群功能
小鼠粪便细菌微生物丰富度分析：对空白组、灌胃前组和实验组3组小鼠粪便样品的微生物菌相构成进行比较并绘制韦恩（Venn）图见图4。由图4可知，3组小鼠粪便的总OTU数量和特有OTU数量均为S组>G组>K组，总OTU数量分别为1235、977和834，特有OTU数量分别为461、200和97。结果表明，实验组的小鼠粪便中细菌物种丰度高于灌胃前组和空白组。
图4 小鼠粪便样品中操作分类单元（OTU）的Venn
小鼠粪便细菌微生物组成：基于科、属水平，空白组、灌胃前组和实验组3组小鼠粪便细菌微生物组成见图5。
图5 基于科（a）、属（b）水平小鼠肠道细菌物种的相对丰度
小鼠粪便细菌微生物多样性分析：通过a多样性分析，3组小鼠粪便样品的微生物多样性结果见图6。由图6可知，空白组、灌胃前组和实验组的Shannon指数差别不大，表明三组小鼠的微生物多样性差异较小。实验组Chao1指数高于灌胃前组和空白组，表明实验组小鼠与灌胃前组、空白组相比微生物的丰富度更高。
图6 小鼠粪便样品微生物α多样性分析结果
03
结论
首次对传统自然发酵法制备的海棠酵素进行微生物菌相分析及功能研究。海棠酵素主要由乳酸菌[（4.4±0.1）×107CFU/mL]、醋酸菌[（5.4±0.1×108)CFU/m L]和酵母菌[（5.0±0.2）×105CFU/m L]组成，经传统微生物培养法分离鉴定得到9株优势菌株，其中4株乳酸菌、2株醋酸菌和3株酵母菌。经高通量测序分析可知，海棠酵素在发酵过程中，发酵0～4d，细菌主要为乳杆菌属（Lactobacillus）、酒球菌属（Oenococcus）、消化链球菌属（Peptostreptococcaceae）、魏斯氏菌属（Weissella），发酵13～31d，主要为乳杆菌属、酒球菌属；发酵0～31d，真菌主要为酵母属（Saccharomyces）和假丝酵母属（Candida）。经a多样性分析可知，海棠酵素细菌丰富度较高，真菌多样性较高。动物实验结果表明，连续灌胃小鼠0.4mL海棠酵素28d后，与空白组和灌胃前组小鼠粪便相比，实验组小鼠粪便增加了乳杆菌属和瘤胃球菌属，减少了枸橼酸杆菌属，具有改善小鼠肠道菌群的能力。
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