CAR-T细胞免疫疗法在血液恶性肿瘤的治疗中取得了巨大的成功。以CAR-T为代表的细胞免疫疗法目前也已经有两款上市，即诺华的Kymriah以及Kite公司（现已被吉列德公司收购）的Yescarta被美国FDA批准用于治疗B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)和弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。对于实体肿瘤而言，目前的CAR-T仍然还面临许多困难，比如治疗实体瘤效果不佳，不能够有效地浸润到肿瘤组织内部，CAR-T细胞生存时间不长等等。近年来已经尝试了许多策略来克服这些障碍，包括用敲除PD-1表达或分泌细胞因子/趋化因子的方法来武装CAR-T细胞，以及将CAR-T细胞与其他治疗方法联用。尽管有这些努力，到目前为止，仍然没有CAR-T细胞疗法被临床批准用于实体肿瘤的治疗。令人振奋和乐观的是，科研人员攻克实体瘤的脚步从未停止。仅在中国就登记了几十项用CAR-T细胞治疗实体瘤的临床试验。为进一步了解CAR-T细胞治疗各种实体肿瘤的现状和趋势，小编介绍下目前CAR-T的技术、障碍以及克服这些障碍的策略进展。
CAR-T技术简介嵌合抗原受体(CAR)是CAR-T的核心成分，它赋予T以不依赖于MHC的方式识别和结合特定的肿瘤相关抗原(TAA)，使其能够识别比天然T细胞表面受体(TCR)更广泛的靶抗原。一个基本的CAR包括肿瘤相关抗原(TAA)结合域(通常来自单克隆抗体抗原结合区的scFv片段)、细胞外铰链域、跨膜域和细胞内信号域。历经十余年 ， CAR-T经历了三代 结构, 每一代结构都是在各个细节上突破, 最终CAR-T往更为精准 、更为高效 、更为持 久 的 方 向 发 展（图1）。第一代CAR介导的T细胞活化是通过CD3ζ链或FcεRIγ上的酪氨酸激活基序完成的。然而第一 代CAR-T只有一个胞内信号组分，T细胞可以被活化，但无法大量增殖 ，持久性很差 ，T细胞增殖减少最终导致凋亡 ，T细胞的抗肿瘤活性在体内受到了很大限制 。第二代CAR-T具有两个胞内信号组分 ， 包括一个共刺激分子 ， 如CD28 、4-1BB 、0X40， 这样的结构决定了T细胞即便没有外源性共刺激分子也可以不断增殖 。诺华的Kymriah以及Kite公司的Yescarta均采用了第二代结构。为了进一步完善CAR的设计，许多研究开始聚焦于第三代CAR的开发，第三代CAR-T具 有 三 个 胞 内 信 号 区 ， 包 括 CD28 、 CD3ζ、 4-1BB 或 0X40 。研 究 表 明 ， 胞 内 有 三 个 共刺激信号的三 代CAR 结 构 使 细 胞 具 有 更 强 的 肿 瘤 裂 解 能 力 和 更 多 的细胞因子分泌，并 在 小 鼠 体 内 具 有 更 强 的 肿 瘤 抑 制 能 力 。第二代和第三代CAR-T在美国、中国和欧洲都有在进行临床试验。
图1. CAR-T结构发展
CAR-T细胞治疗实体瘤的障碍
影响CAR-T细胞治疗实体瘤的因素（图2）
1. CAR-T细胞向肿瘤部位转运为了与肿瘤表面的目标蛋白结合，CAR-T细胞首先需要运输到肿瘤部位。这是T细胞免疫疗法正常发挥作用的基本前提。与血液瘤不同，在实体瘤的情况下，T细胞向肿瘤部位的转移和浸润往往受到免疫抑制微环境的极大限制。此外，与容易被CAR-T细胞靶向和到达的血液瘤不同，实体瘤分泌的一些趋化因子，如CXCL1、CXCL12和CXCL5阻止T细胞向肿瘤病变转移和浸润。由于T细胞上缺乏相应的趋化因子受体，使其很难运输和浸润到肿瘤部位，严重阻碍了CAR-T细胞发挥其所设计的免疫杀伤肿瘤细胞的能力。因此，为了克服这一障碍，需要对T细胞进行修饰，使其表达与相应的肿瘤源性趋化因子相匹配的趋化因子受体，使得DC细胞以及T细胞浸润到肿瘤组织内部一起杀伤肿瘤。2.CAR-T细胞浸润肿瘤一旦CAR-T细胞成功转运到肿瘤部位，浸润到肿瘤微环境是发挥抗肿瘤作用所必需的关键步骤。这是一个非常动态和受调控的复杂步骤：它涉及滚动、粘附、外渗和趋化作用。实体瘤具有独特的组织病理学特征，如大量的血管，以及肿瘤相关的成纤维细胞和髓样细胞形成细胞外基质。虽然这些特征有利于实体肿瘤的生长，但也给肿瘤部位的T细胞浸润带来了困难，从而阻止了T细胞与肿瘤细胞之间的持续接触，而这是T细胞发挥细胞毒抗肿瘤作用所必需的。3.实体瘤微环境的免疫抑制状态实体瘤内免疫抑制微环境具有特殊的组织病理学特征，表现为血管密度高、血管渗漏广泛、组织结构完整性差等。这些变化导致缺氧、低pH值、免疫抑制细胞、抑制性检查点的增加，以及更多的肿瘤衍生细胞因子。以下是影响T细胞抗肿瘤作用的TME中的三个主要因素：
3.1免疫抑制细胞
实体瘤通常由大量的免疫抑制细胞组成，如调节性T细胞(Tregs)、髓源性抑制细胞(MDSCs)和肿瘤相关巨噬细胞(TAM)。这些细胞都起到保护实体肿瘤细胞不被宿主免疫系统杀死的作用。理论上，共刺激分子，如CD28和CD137，可能有利于肿瘤部位CAR-T细胞的激活和存活。此外，阻断粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)依赖的MDSC的扩增和PD-L1的表达可能是增强CAR-T细胞抗肿瘤作用的潜在途径。
3.2肿瘤来源的细胞因子
肿瘤源性细胞因子是阻碍实体瘤肿瘤免疫治疗效果的可溶性因子。TGF-β是一种抑制性肿瘤细胞因子，在抑制抗肿瘤反应中发挥重要作用。TGF-β可以减弱CD8+效应T细胞功能，并可以促进Treg成熟。因此，理论上用抗体或小分子药物中和TGF-β改善CD8+T细胞的功能。此外，细胞因子的激活，如白细胞介素IL-2和IL-15，提高了CAR-T细胞的抗肿瘤效果，特别是IL-12可以改变肿瘤微环境，通过招募和激活巨噬细胞和其他天然免疫细胞来消除肿瘤细胞，延长T细胞的存活期，因此提高了抗肿瘤疗效。
3.3检查点抑制配体
抑制性免疫检查点配体诱导免疫反应的抑制功能，通常在实体瘤中过度表达。例如，PD-L1是PD-1受体的配体，通过与PD-1结合来抑制CAR-T细胞的激活。目前抑制性免疫检查点抗体正在与CAR-T细胞联合治疗进行了多项临床试验。4.免疫相关不良事件(IrAEs)实体肿瘤CAR-T细胞治疗的主要挑战之一是irAEs。有两个主要机制导致CAR-T细胞疗法的毒性增加。
4.1靶向/肿瘤毒性
CAR-T细胞免疫治疗后最危及生命的毒性是靶点/肿瘤上的毒性，它与不良反应有关，如细胞因子释放综合征(CRS)。当与靶肿瘤细胞上的抗原结合时，输注的CAR-T细胞被广泛激活，导致大量炎性细胞因子的释放。CRS的症状包括发烧、乏力、恶心、呕吐、腹泻、皮疹、神志不清、幻觉、低血压，甚至严重的多器官衰竭。IL-6似乎是CRS的主要介质，因此，改善这种副作用可以使用IL-6R抑制剂tocilizumab。FDA已于8月批准tocilizumab治疗CAR-T细胞诱导的CRS。
4.2靶上/肿瘤外毒性
另一种毒性来源于CAR-T细胞与靶抗原的结合，而该抗原也在正常细胞上表达。这种毒性可能导致健康细胞和器官的破坏。大多数CAR-T细胞靶抗原似乎不是肿瘤特异性的。因此，抗原特异性成为CAR-T治疗的关键因素。为了降低这种毒性的风险，针对CAR-T细胞的安全抗原的选择性至关重要，可以通过利用双CAR靶向和调节单链可变片段(ScFv)的亲和力来改善。5.抗原特异性实体瘤的主要生物学特征之一是异质性。肿瘤的异质性显着影响免疫治疗效果，因为免疫靶点可能局限于一定数量的实体瘤细胞。因此，在CAR-T细胞治疗中，提高靶点特异性和消除毒性是必要的。EGFR变异体III(EGFRvIII)被认为是CAR-T细胞唯一的肿瘤特异性抗原(TSA)。研究发现它只在人类癌细胞而不是正常健康细胞上表达，EGFRvIII靶向的CAR-T细胞精确靶向肿瘤细胞，有助于提高疗效和降低毒性。当然TSA的短缺严重限制了CAR-T疗法的应用。提高CAR-T细胞治疗实体瘤的策略1. 改善CAR-T细胞转运和浸润CAR-T细胞转运需要肿瘤细胞分泌的趋化因子与效应T细胞上的趋化因子受体之间建立趋化迁移。不同的肿瘤类型会产生不同的趋化因子，因此相应的趋化因子及其相应的趋化因子受体是T细胞成功转运到肿瘤部位的关键因素。与肿瘤细胞上的配体CXCL1结合的带有趋化因子受体CXCR2的T细胞已被证明能有效地向黑色素瘤转运。淋巴器官之中的纤维网状细胞（Fibroblastic reticular cells）分泌的IL-17和CCL19能够将外围的T细胞和DC细胞有效地招募过来，以便维持T细胞集中的区域。在着名学术期刊Nature biotecnology发表了一篇题为“IL-7 and CCL19 expression in CAR-T cellsimproves immune cell infiltration and CAR-T cell survival in the tumor”文章，来自日本的科学家团队通过将IL-17以及CCL-19基因转入CAR-T细胞制备出能够有效杀伤肿瘤的“超级CAR-T细胞” 能够让患有肿瘤的小鼠几乎100%生存，这种细胞在体内存活时间更长并且能够有效地杀伤肿瘤细胞.VEGFR-2在肿瘤相关的内皮细胞上高表达，已被选为促进T细胞浸润的另一个候选者。携带VEGFR-2的CAR-T细胞已被证明可以产生持久的、增加的肿瘤浸润和增强的抗肿瘤效果；FSHR（卵泡刺激素受体）对肿瘤血管生成也有促进作用，在许多肿瘤血管中都有表达，例如卵巢，肺，头颈，胰腺，肝等肿瘤，而在健康组织中不表达。Anixa Biosciences公司设计的 FSHR-CAR-T疗法（图3），将 CAR-T被改造表达FSH，以此识别并杀死表达FSHR的癌细胞，破坏肿瘤血管生长，进而抑制肿瘤生长。这种CAR-T细胞可能对TME免疫抑制不敏感，使得实体肿瘤更容易被渗透，其有望是第一个抗血管生成治疗实体瘤的CAR-T药物。
图3. FSHR-CAR-T结构示意图通过腹腔和肿瘤内注射的区域传送T细胞也是传送CAR-T细胞的一种直接方式。在一项I期临床试验研究中，以ErbB为靶点的CAR-T细胞通过肿瘤内注射输送给头颈部鳞癌患者2. 免疫抑制微环境的逆转临床前数据显示，将共刺激分子掺入CAR-T有助于CAR-T细胞逆转免疫抑制的肿瘤微环境，例如，CD28共刺激克服了TGF-β介导的增殖抑制，并增强了T细胞对Treg细胞的抵抗力。也有研究证实通过在CAR-T细胞上引入TGF受体来抑制免疫抑制细胞因子可以提高CAR-T细胞的疗效。在肿瘤微环境中，激活细胞因子(如IL-2、IL-12、IL-15)可以拮抗免疫抑制因子的作用，提高CAR-T细胞的效能。致力于开发基于同种异体基因编辑的CAR-T细胞(UCART)的法国生物科技公司Cellectis研究人员通过使用该公司专有的TALEN® 技术，重新利用T细胞活化途径的三个主要参与者TCRα、CD25和PD1基因，从而使得CAR-T细胞能够通过以肿瘤和时间依赖性方式微量分泌促炎细胞因子IL-12重塑肿瘤微环境（图4）。研究中，与4只未经治疗的小鼠相比，细胞疗法显着提高了7只淋巴瘤小鼠的存活率。因此能分泌细胞因子的“装甲”CAR-T细胞，这是一种非常有前途的改善CAR-T细胞功能的策略。
图4. TRACCART细胞与肿瘤细胞的结示意图肿瘤微环境发挥免疫抑制作用的一个主要机制是诱导细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)和程序性死亡-1(PD-1)等表面抑制受体的表达上调。这些分子在抗原-受体结合后自然上调，以抑制组织内T细胞的激活，并维持外周耐受。对于黑色素瘤和肾癌等癌症的治疗，检查点抑制剂的应用，如PD1，CTLA-4和PD-L1抗体，可以改善患者的T细胞功能。研究也证实阻断PD1介导的免疫抑制也能增强CAR-T细胞的治疗效果。由广东药科大学附属第一医院、广州安捷生物医学技术有限公司以及悉尼科技大学合作开展报道了全球首个PD-1敲除的MUC-1 CAR-T治疗晚期非小细胞肺癌初步研究数据，研究初步结果显示PD-1敲除的MUC-1 CAR-T治疗安全，可耐受，部分患者肿瘤明显缩小，所有入组患者的症状均有改善。来自 Memorial Sloan Kettering Cancer Center的Renier J Brentjens 课题组通过修饰CAR-T细胞以分泌PD-1抗体的单链可变片段（scFv）（图5）。这些分泌scFv的CAR-T细胞以旁分泌和自分泌方式起作用，以改善CAR-T细胞和肿瘤特异性T细胞抗肿瘤活性。这种方法可以提高安全性，因为分泌的scFv仍然定位于肿瘤，保护CAR-T细胞免受PD-1抑制，这可能潜在地避免与全身检查点抑制相关的毒性。使用了多个体内模型都证明了分泌PD-1 scFv的CAR-T细胞增强了小鼠的存活。研究结果还表明了分泌PD-1 scFv的CAR-T细胞与用CAR-T细胞和PD-1 mAb联合治疗同样有效甚至更加优越，表明PD-1阻断的局部递送在增强CAR-T细胞功能方面是有效的。相关成果发表在题为“Targeted delivery of a PD-1-blocking scFv by CAR-T cells enhances anti-tumor efficacy in vivo”的Nature Biotechnology学术期刊上。
图5. 分泌scFv的CAR-T细胞的旁观者效应的示意图3. 多靶向肿瘤表面抗原的CAR-T细胞疗法鉴于肿瘤的异质性和抗原逃逸变异，CAR-T细胞治疗的下一步发展是靶向多个抗原，类似于传统化疗的组合策略。这种方法通过靶向肿瘤微环境中的多个TAA或其他因素，增加了消除肿瘤的机会。有多种方法可以创造多特异性CAR-T细胞。基本方法一是构建一个包含两种单一CAR-T细胞产品的池，即“CAR池”。研究证实，以EphA2为靶标的CAR和以FAPα为靶标的CAR来靶向肿瘤微环境，与单独应用任何一种CAR相比，这种组合在显示了更显着的肿瘤杀伤作用。另一个方法是让两个(双特异性bi-CAR)或更多(Tri-CARs)在T细胞中共表表达，这样单个T细胞也可以具有双重或多重抗原靶向的功能。HER2和IL13Rα2是抗肿瘤疗法的比较好的候选分子，这是因为它们在大多数胶质母细胞瘤细胞表面上表达，但是体内正常组织中表达水平较低。发表在Journal of Clinical Investigation期刊上题为 “Tandem CAR T cells targeting HER2 and IL13Rα2 mitigate tumor antigen escape” 文章中，以美国贝勒医学院为代表的研究人员发现在胶质母细胞瘤模型中，共表达HER2和IL13Rα2CAR分子的Bi-CAR-T同时识别HER2和IL13Rα2，而且它的抗肿瘤活性要比使用各自的单价CAR分子好很多。4. 将CAR-T细胞毒性降至最低到目前为止，EGFRvIII是唯一的肿瘤特异性CAR抗原，它完全局限于人类癌症，主要发现于胶质母细胞瘤。EGFRvIII阳性的肿瘤细胞可以被特定的CAR-T细胞精确靶向，从而提高治疗效果并降低相应的毒性。在胶质母细胞瘤的动物模型研究中，EGFRvIII CAR治疗产生了非常有希望的结果。李宗海/蒋华课题组与科济生物医药团队开发了一个人源化抗体，可以同时识别肿瘤细胞中的EGFR和EGFRvIII，但不识别正常组织中的EGFR，这样既做到一箭双雕，而且可以避免在靶脱瘤的毒副反应。其体外试验表明，该CAR-T细胞对于EGFR或EGFRvIII高表达的肿瘤细胞可以有效杀伤，但对高表达EGFR的正常细胞如角质上皮细胞没有明显杀伤；而进一步的动物实验表明，利用该单链抗体构建的CAR-T细胞可以有效清除颅内的EGFRvIII以及EGFR阳性胶母细胞瘤。另外已经开发了各种靶向策略来提高CAR-T细胞治疗的特异性和安全性。一种策略是用两种不同的CAR修饰T细胞，从而有效地诱导肿瘤细胞和正常细胞分化。由中国武汉的华中科技大学和Cellyan Therapeutics公司联合进行I期临床试验,检验了一款同时靶向BCMA和CD38两种抗原的双靶点CAR-T疗法。它将靶向CD38和BCMA的单链抗体可变区片段与4-1BB和CD3ζ蛋白域融合在一起。通过同时靶向这两种抗原，希望获得更好的肿瘤杀伤作用的同时而又不增加毒副作用。
调节CAR的ScFv亲和力也可以增强肿瘤特异性。降低CAR的亲和力可以使表达靶抗原的正常细胞处于较低水平，从而避免靶上/肿瘤外效应。研究报道，亲和力降低约1000倍的CD38靶向CAR被证实更适合于治疗多发性骨髓瘤；具有微摩尔亲和力的ICAM-1靶向CAR比纳摩尔亲和力CAR更适合治疗实体瘤。因此，在实体瘤过表达抗原的CAR-T细胞治疗中，通过ScFv的亲和力调节是一条很有前途的策略。
小编总结
CAR-T细胞疗法已经在血液瘤中得到验证并取得了成功，但目前在实体肿瘤中的成功率很低。为了使实体肿瘤患者受益，科研人员在 CAR分子设计方面，TME内靶点的选择，改善CAR-T细胞转运和浸润，克服实体肿瘤免疫抑制微环境以及如何降低毒性方面，做了各种各样的尝试和努力，目前也取得了一定的突破和成功。小编相信将CAR-T细胞疗法从仅仅是“有希望的”转变为对实体肿瘤的“有效”治疗将在不久就变为现实，从而使更多的实体瘤患者受益。
参 考 文 献
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3. Scarfò I Maus MV, et al., Current approaches to increase CAR T cell potency in solid tumors: targeting the tumor microenvironment, J Immunother Cancer, () 5:28.
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6. Keishi Adachi , et al., IL-7 and CCL19 expression in CAR-T cells improves immune cell infiltration and CAR-T cell survival in the tumor, Nature Biotechnology () 36,346–351.
7. Meenakshi Hegde , et al., Tandem CAR T cells targeting HER2 and IL13Rα2 mitigate tumor antigen escape, J Clin Invest, ()126:3036-3052.
8. Anixa Biosciences公司及其他公司官网。
