深低温冷冻保存是保存HSC(干细胞)最常用的方法。在低温中细胞代谢和各种酶的活动几乎完全停止，故保存的时间得以延长，而且温度越低可保存的时间越长。HSC在-80℃可保存1~2年，在-196℃中则可长期保存。为了取得好的保存效果，应注意以下几个环节的处理。
1、采用冷冻保护剂
降温分为慢速降温和快速降温，慢速降温会形成细胞外冰晶，细胞外渗透压增加，引起细胞脱水；快速降温则会使细胞内结冰，引起细胞机械损伤，两者的冰晶损伤均可导致细胞死亡。解决这一问题的方法是采用冷冻保护剂。
冷冻保护剂即防冻剂分为细胞内和细胞外防冻剂。细胞内防冻剂如甘油、二甲基亚矾(DMSO)等；细胞外防冻剂如乙基淀粉(HES)、右旋糖酥(DEX)等，是大分子溶液，高分子量，溶质较少，不能透过细胞膜，它们在浓度增加到一定程度，减少细胞损伤。冷冻保护液除了有防冻剂外，还有糖盐溶液及血浆蛋白等，增加蛋白的浓度或细胞内外防冻剂联合应用可以提高细胞存活率。
2、冷冻保存生物干细胞前移植物处理
采集到的BM和外周血中含有多种细胞成分，不同细胞的保存条件如防冻剂种类及浓度、降温速度等存在差异，对干细胞的冷冻保存条件仅适合于生物干细胞，其他成熟细胞在冷冻保存后会被破坏，出现絮状沉淀、引起输注相关毒性，如溶血所致的血红蛋白尿，严重时甚至发生急性肾功能衰竭。因此，在冷冻前需对采集的生物干细胞进行处理，BM需提取白膜或MNC部分以去除大部分红细胞；外周血在采集时应设定采集MNC程序，使采集物中RBC的含量降低。
3、降温速度
降温速度是影响生物干细胞冷冻保存质量的重要因素，生物干细胞冷冻保存时合适的冷冻速度是1~3℃/min。应用5%~10%的DMSO做防冻剂，降温速度分别为1℃/min、5℃/min及10℃/min时生物干细胞的回收率，结果DMSO在实验浓度下对细胞回收率无明显影响，但降温速度对细胞回收率的影响却非常大，随着降温速度的增大，细胞回输率降低，以10%的DMSO为例，在降温速度分别为1、3、5℃/min时，干细胞的回收率分别为85%、58%和30%，三者之间有显著性差异。
4、冷冻细胞的保存
生物干细胞如果在程控降温过程中没有受到损伤，那么在储存过程中，只要储存的温度足够低，能够封闭整个细胞所有酶的代谢途径，在理论上样品无论储存多长时间都不会引起细胞存活率的改变。因此认为，储存的温度越低越好。目前大部分实验室是采用液氮来储存标本。在液氮中储存标本分为两种方式，一种是利用液氨蒸气储存，液氮蒸气的温度范围为-100~-194℃。
另一种方法是储存于液氮-196℃中。有报道生物干细胞冷冻保存后回输给移植患者，仍能重建造血功能。36例患者应用冷冻保存中位2.7(2.0~7.8)年的生物干细胞进行AHSCT，其粒细胞与血小板的恢复时间与应用短期冷冻保存HSC进行AHSCT患者无显著性差异。28份中位保存4.4年的生物干细胞进行CFU-GM及BFU-E集落培养时，发现集落的产率没有随着保存时间的延长而降低。
5、解冻
生物干细胞的解冻过程十分重要，操作不当易引起细胞肿胀，破裂死亡，当应用的细胞内防冻剂扩散速度慢时，发生的程度更严重。因此，主张采用快速解冻，缩短细胞熔化肿胀过程，同时还以避免再结晶及重新形成冰块。
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